In der Anfangsequenz des Films (1912) gelingt es dem jungen Indiana Jones als Pfadfinder in einer Felsenhöhle in Utah, das Kreuz von Coronado zwielichtigen Schatzsuchern zu entwenden. Nach einer Verfolgungsjagd zu Fuß, zu Pferd und mit einem Zirkuszug gelangt er schließlich nach Hause. Sein Vater, der gerade beschäftigt ist, will allerdings nichts davon wissen, und so muss Indiana das Kreuz aufgrund des US-amerikanischen Finderrechts zurückgeben. Erst als erwachsener Mann (Zeitsprung nach 1938) gelingt es ihm endlich, das Kreuz wiederzufinden und einem Museum zu übergeben.
Nun beginnt die eigentliche Handlung des Films, in dem sich Dr. Henry Jones Junior, genannt Indiana Jones, und sein Vater, Dr. Henry Jones, ein erbittertes Rennen um den Heiligen Gral mit deutschen Nationalsozialisten liefern. Dieser Kelch soll der Legende nach ungeheure Kräfte besitzen und der Schlüssel zur ewigen Jugend sein. Der Sage nach wurde der Gral schon einmal während der Kreuzzüge von drei Rittern gefunden. Nur einer von ihnen kehrte lebend nach Europa zurück und gab vor seinem Tod das Wissen um die Existenz des Relikts weiter.